Метод флюоресцирующих антител

Непрямой метод флуоресцирующих антител.

Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА) или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют с целью выявления специфических антител у больных и переболевших риккетсиозами людей и животных.

Метод используют следующим образом. В ампулу с сухим риккетсиальным корпускулярным антигеном за 2 часа до приготовления препарата добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения корпускул риккетсий влагой. Из этого основного разведения готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающей в каждом поле зрения примерно до 100 риккетсиальных клеток. На предметном стекле, хорошо вымытом и обезжиренном, наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На каждое стекло наносят 8 капель. Этого количества достаточно для испытания одной сыворотки. Если в вашем распоряжении имеется взвесь антигена, то с ней поступают следующим образом: из основного раствора готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающей в каждом поле зрения около 100 риккетсиальных клеток. На предметное стекло, хорошо вымытое и обезжиренное наносят по 8 капель антигена, тщательно перемешанного пипетированием в соответствующем рабочем разведении кончиком канцелярского пера или туберкулиновым шприцем со срезанным концом.

Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или ацетоном (приобретенные антигенные пятна уже зафиксированы) в течение 20 минут и сохраняют до использования при температуре от 0 до +4°С, в пределах месяца. Препараты необходимо оберегать от увлажнения.

Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30 минут при +56°С, готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (от 1:20 до 1:2560, а при необходимости и выше).

Капли из соответствующих разведений сыворотки наносят на мазки антигена и выдерживают 45 минут во влажной камере при +37°С. Затем препарат промывают фосфатным буфером (pH = 7,2 — 7,4) в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

После высушивания на мазки наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере 30 минут при +37°С. В качестве антивидовых препаратов применяют люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека и животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется использование бычьего альбумина, меченого родамином или 0,1% раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов. Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут и высушивают на воздухе.


В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно антивидовой люминесцирующей сывороткой.

Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливает свечение риккетсий на «++», при наличии свечения на «+++» или «++++» в предыдущем разведении.

Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки — свечение риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей антивидовой сывороткой в рабочем разведении.

2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих антител.

Прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА) используется с целью выявления риккетсиальных антигенов в биологических пробах и объектах внешней среды.

Метод осуществляют следующим образом. На тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла делают тонкие мазки или отпечатки исследуемого материала. После высыхания мазки фиксируют этиловым спиртом или ацетоном в течение 30 минут. По мазку восковым карандашом делают ряд окружностей диаметром 0,5 см, в зависимости от количества искомых антигенов, чтобы создать барьер, препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.

На эти поля фиксированных и высушенных мазков наносят по капле разведенных флуоресцирующих сывороток против искомых антигенов (рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом Эванса 0,1% или бычьего альбумина, меченого родамином (в смеси оба раствора должны быть в рабочем разведении). В контрольное поле наносят гетерологичную флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 минут при температуре +37°С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном растворе (pH = 7,2 — 7,4) в течение 10 минут. После ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют в люминесцентном микроскопе.


Учет результатов реакции.

Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, объектив 90х, окуляр 10х или 7х. Первичные светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС 7-2; БС-8-2, окулярный или запирающий — 2; для ЛЮМАМ — ФС 1-4; СЗС 21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатом и изотиоцианата флуоресцеина).

Просматривают не менее 10 — 20 полей зрения. Оценку результатов пМФА проводят на основании количества, яркости флуоресцеина и морфологических особенностей риккетсий. Для этого используют условную систему обозначения при помощи крестов:

«+++++» — яркая, сверкающая флуоресценция;

«+++» — отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с характерными для данного флуорохрома цветов (в данном случае зеленый).

Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого свечения комплекса антител с поверхностным антигеном;

«++» — флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;

«+» — флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий различима плохо, цвет неопределенный;

«-» — флуоресценция отсутствует.

Результат считается положительным при обнаружении в некоторых полях зрения не менее 5 риккетсий с интенсивностью свечения возбудителя не менее, чем на «+++» при четко отрицательном контроле.

вирусология шпоры / метод флюоресцирующих антител и его использование в вирусологии

Принцип метода флюоресцирующих антител (МФА) основан на визуальном учете специфического взаимодействия флуюоресцирующих антител с гомологичным антигеном.

Образующийся при этом комплекс антиген — антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа.

Этот метод как однофазная серологическая реакция включает лишь первую специфическую фазу; этим он отличается от РА и РП, состоящих из специфической и неспецифической фаз.

Преимущества МФА: 1) экспресс-метод — быстрое получение результатов; 2) довольно высокая чувствительность и универсальность применения для обнаружения различных антигенов (бактериальных, вирусных, риккетсиозных и др.); 3) простота постановки.

К недостаткам МФА следует отнести необходимость специального оборудования — люминесцентного микроскопа, который не всегда имеется в районных ветеринарных лабораториях.

Практическое использование. МФА в первую очередь следует применять при особо опасных инфекциях (сибирская язва, сап, мелиоидоз), а также для диагностики медленно развивающихся и трудно культивируемых микроорганизмов (возбудителя туберкулеза и паратуберкулеза).

При сапе МФА является одним из наиболее чувствительных, специфических и достоверных методов быстрого обнаружения возбудителя (в течение 1…2 ч). Для его выявления используют иммуноглобулины диагностические флюоресцирующие сапные моноклональные мышиные сухие. Препарат окрашивает только бактерии сапа, не окрашивая возбудителя мелиоидоза. Чувствительность метода в зависимости от объекта исследования составляет 5 ∙ 104…5 ∙ 106 м. т./мл.

Прямую модификацию используют для диагностики сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии, псевдотуберкулеза и т. д. Непрямую методику также с успехом применяют для индикации сибирской язвы, мелиоидоза, туляремии и т. д.

При изучении роли мяса как фактора передачи иерсиниозной инфекции оказалось, что непрямой вариант МФА в 2 раза эффективнее по сравнению с культуральным при выявлении Y. enterocolitica в мясе и мясных продуктах: чувствительность метода составляла 1 ∙ 104 м. т./мл (И. С. Киселева, 2005).

Люминесцентный метод применяют для обнаружения возбудителя туберкулеза в исследуемом материале. Для этого мазки из патологического исследуемого материала хорошо высушивают при осторожном подогревании, фиксируют 10…15 мин в жидкости Никифорова. Затем мазки окрашивают флюорохромными красителями, приготовленными по одной из следующих прописей:

I. 1. Аурамин 0 — 0,5 г

2. Родамин 0 — 0,05 г

3. Дистиллированная вода — 1000 мл

II. 1. Акридин оранжевый — 0,1 г

2. Дистиллированная вода — 1000 мл

Окрашивание производят через фильтровальную бумагу при легком подогревании в течение 15 мин. Затем осторожно промывают мазок водопроводной водой, дифференцируют 3%-м раствором солянокислого спирта (15 с), промывают дистиллированной водой. После гашения фона 0,25%-м водным раствором метиленового синего или водным раствором кислого фуксина (1: 1000) в течение 30 с тщательно промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют. Возбудитель туберкулеза светится обычно золотисто-оранжевым цветом на черном фоне (картина звездного неба), цитоплазма микобактерий плотная. Сапрофиты после гашения фона выглядят как серо-зеленые, изумрудно-зеленые или лимонно-золотистые палочки на светло-зеленом фоне.

В настоящее время в лабораториях, занимающихся диагностикой туберкулеза, люминесцентная микроскопия постепенно вытесняет методику окраски по Цилю—Нильсену.

МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА). ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Цель занятия. Ознакомить студентов с принципом метода флуоресцирующих антител и техникой постановки реакции иммунофлуоресценции, с принципом и техникой проведения им-муноферментного анализа.

Оборудование и материалы. Инактивированные культуры бруцелл и сальмонелл, 96%-й этанол, ФСБР (рН 7,2…7,4), «влажная камера» (чашки Петри, эксикатор), люминесцирующие сыворот­ки против бруцелл, сальмонелл, иммуноглобулинов кролика, по­зитивная бруцеллезная сыворотка, готовый препарат для демон­страции результатов ИФА, люминесцентный микроскоп.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

В названных серологических реакциях используют антитела (иммунные сыворотки), меченные флуорохромом или фермента­ми, и в дальнейшем, применяя специальные методы, регистри­руют образование комплекса антиген — антитело. В некоторых вариантах ИФА ферментную метку вводят в антиген.

Метод флуоресцирующих антител (МФА). Этот комплексный метод сочетает в себе серологическую реакцию, при которой происходит специфическое взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, и микроскопическое ис­следование, с помощью которого этот комплекс обнаруживают.

В реакции иммунофлуоресценции используют антитела, к ко­торым присоединен флуорохром (чаще флуоресцеин — изотиоцинат). Такие антитела сохраняют способность специфически реагировать с антигеном и благодаря флуорохрому светиться под воздействием ультрафиолетовых лучей. При постановке МФА микробный антиген фиксируют на предметном стекле и обраба­тывают люминесцирующими антителами. Затем препарат отмы­вают водой от несвязавшихся антител и просматривают в люми­несцентном микроскопе. Если антитела специфически соответ­ствуют данному антигену, то они образуют с антигеном прочный комплекс и при люминесцентной микроскопии в препарате об­наруживают светящиеся микробные клетки (рис. 70).

Преимущество МФА как диагностического метода состоит в том, что с его помощью возможно за два-три часа серологически идентифицировать микроорганизм непосредственно в патологи­ческом материале, без выделения в чистой культуре (экспресс-метод). Как и другие серологические реакции, МФА применяют и для выявления антител в крови животных.

Приготовление препарата для МФА. При выявлении возбуди­теля инфекции (антигена) на предметном стекле готовят мазки-отпечатки из органов или другого материала. Чтобы обнаружить антитела в исследуемой сыворотке крови, на предметном стекле готовят мазки из известного антигена, например возбудителя сальмонеллеза, сибирской язвы и др. Препарат с нанесенным материалом (бактериальная суспензия, мазок-отпечаток) подсу­шивают на воздухе и фиксируют ацетоном (5 мин), или этанолом (10…. 15 мин), или метанолом (5…10 мин). Препарат можно фик­сировать и нагреванием, как при обычной световой микроско­пии. Мазки-отпечатки из органов и тканей лучше обрабатывать охлажденным до -20 °С ацетоном 2…4 мин. В зависимости от конкретных задач окрашивание готовых препаратов люминесци­рующими сыворотками проводят различными способами.

Прямой МФА. Разработал Coons с соавт. (1950). На предмет­ное стекло с фиксированным антигеном наносят каплю люминесцирующей иммунной сыворотки в рабочем разведении, со­держащей антитела против искомого антигена. Чтобы избежать высыхания, препарат помещают во влажную камеру (чашку Пет­ри) с фильтровальной бумагой, смоченной водой, и выдержива­ют в термостате при 37…38 °С 15…30 мин. Затем препарат 5… 10 мин промывают от несвязавшихся иммуноглобулинов про­точной (водопроводной) водой с рН не ниже 7,0. Промытый пре­парат высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Прямой МФА используют только для идентификации неизве­стного антигена; к его недостатку относят необходимость приго­товления люминесцирующей сыворотки для каждого вида иден­тифицируемого микроорганизма.

Непрямой МФА.Применяют в двух вариантах.

Двухступенчатый МФА предложили Weller и Coons (1954). Этот вариант считают более универсальным, так как при помощи одной люминесцирующей антивидовой сыво­ротки можно выявлять различные виды микроорганизмов.

На антиген наносят каплю немеченной иммунной сыворотки (сыворотка первой ступени). Препарат выдерживают в термоста­те 15…30 мин, затем его промывают, чтобы удалить несвязавшиеся антитела иммунной сыворотки, и просушивают (см. прямой вариант). Если антитела сыворотки первой ступени соответству­ют антигену, то вода не вымывает образовавшийся АГ—АТ-комплекс (антитела зафиксированы на антигене).

На подсушенный препарат наносят каплю люминесцирую­щей антивидовой сыворотки (сыворотка второй ступени) в ра­бочем титре. Препарат повторно помещают в термостат во влажной камере на 15…30 мин, затем промывают водой и под­сушивают. Антивидовая сыворотка представляет собой мечен­ные флуорохромом антитела против иммуноглобулинов крови животного того вида, от которого получена иммунная сыворот­ка первой ступени. Таким образом, антитела первой сыворотки служат антигеном для меченых антител антивидовой сыворот­ки. В результате к образовавшемуся на первом этапе АГ—АТ-комплексу присоединяются антитела второй ступени, образует­ся двойной комплекс, который можно обнаружить в люминес­центном микроскопе.

Универсальность непрямого варианта обусловлена тем, что, используя на первом этапе полученные от животных одного вида (например, от лошадей) иммунные сыворотки против различных микроорганизмов, на втором этапе с помощью одной антивидо­вой сыворотки можно идентифицировать неограниченное коли­чество возбудителей инфекционных болезней.

Трехступенчатый МФА представляет собой вари­ант РСК на стекле. В данном случае в иммунном комплексе на стекле при помощи люминесцирующей сыворотки выявляют связанный комплемент (рис. 71).

Двухступенчатым или трехступенчатым МФА при использова­нии известного антигена можно обнаруживать антитела в крови животных.

Для подтверждения специфичности результатов МФА необхо­димы контроли. Для прямого варианта достаточно одного конт­роля: гомологичные и гетерологичные в антигенном отношении микроорганизмы обрабатывают люминесцирующей сывороткой. В первом случае наблюдают свечение бактерий, во втором свече­ние отсутствует.

Для непрямого варианта ставят два контроля: 1) мазки, содер­жащие гомологичные и гетерологичные в антигенном отноше­нии микроорганизмы, обрабатывают антивидовой люминесциру­ющей сывороткой. При отсутствии антител первой ступени клет­ки не должны люминесцировать; 2) мазки с гомологичными и ге-терологичными в антигенном отношении бактериями обра­батывают иммунной (антимикробной) сывороткой (первый этап) с последующим нанесением флуоресцирующей антиглобулино-вой (антивидовой) сыворотки (второй этап). Специфическое све­чение бактерий наблюдают в первом случае, во втором оно от­сутствует.

Оценка результатов МФА. Учитывают яркость свечения, цвет, локализацию и структуру свечения. У бактерий, окрашенных (обработанных) люминесцирующей сывороткой, меченной изоцианатом флуоресцеина, обычно наблюдают яркое зеленое све­чение по периферии клетки в виде ободка или ореола, централь­ная часть бактерий светится слабо. Такой характер свечения объясняют тем, что с единицы площади по периферии микроб­ной клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в не­сколько раз больше антител, чем с центральной ее части. Следует учитывать, что у пластичных бактерий (лептоспиры, вибрионы) светится вся клетка. У клеток, погруженных в тканевую жид­кость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.

Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой си­стеме: 1) (++++) — очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темной централь­ной частью клетки; 2) (+++) — яркая флуоресценция периферии клетки; 3) (++) — слабое свечение периферии клетки; 4) (+) — нет контрастного свечения периферии и центральной части мик­робной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают знаком «минус» (видны тени микроорганизмов). При диагности­ке различных возбудителей болезней положительным результа­том чаще считают специфическое свечение бактериальных кле­ток не ниже, чем на четыре или три креста.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Этот метод получил рас­пространение после того, как была решена задача введения фер­ментной метки в молекулы антител или антигенов. Антитела, связанные с ферментом, сохраняют способность специфически реагировать с гомологичным антигеном, а фермент — взаимодей­ствовать с соответствующим субстратом.

ИФА обычно используют в гистохимическом (иммунопероксидазная реакция) и твердофазном вариантах.

Гистохимический ИФА. При помощи этого метода обычно об­наруживают микробные антигены в мазках-отпечатках, мазках крови, гистосрезах. Как и в случае МФА, пероксидазную реак­цию используют в прямом и непрямом вариантах.

Прямая иммунопероксидазная реакция. В качестве известного компонента используют, меченные пероксидазой антитела против какого-либо патогенного микроорганизма. Препарат, например мазки-отпечатки, фиксируют охлажден­ным ацетоном (-15…-20 °С), подсушивают, наносят четыре-пять капель конъюгата в рабочем титре (меченые антитела), инкуби­руют во влажной камере при 37 °С 1…2ч, промывают физиологи­ческим раствором 15 мин, ополаскивают дистиллированной во­дой, подсушивают, наносят на препарат несколько капель ра­створа субстрата (25 мг 3,3-ДАБ • 4НС1 растворяют в 100 мл 0,05 М трис-буфера с рН 7,5 и 25 мл этого раствора объединяют с 3 мл 0,5%-го раствора перекиси водорода). Препарат с субстра­том выдерживают 5…10 мин, промывают в физиологическом ра­створе 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой и микро­скопируют.

Если в исследуемом материале присутствует искомый микроб­ный антиген, то меченные пероксидазой антитела с ним специфически связываются. Внесение субстрата к пероксидазе приво­дит к образованию цветного продукта, видимого при микроско­пии сначала как гранулы голубого, а позднее желто-коричневого цвета.

Непрямая иммунопероксидазная реак­ция. Как и в МФА, используют меченные пероксидазой анти­тела иммуноглобудинам определенного вида животных. На первом этапе фиксированный охлажденным ацетоном препарат с исследуемым материалом обрабатывают во влажной камере при 37…38 ºС 1…2 ч. иммунной сывороткой (0,2…0,3 мл), содержащей немеченые антитела к искомому антигену. Затем препарат про­мывают физиологическим раствором 5 мин, подсушивают и об­рабатывают при 37…38 °С 1…6ч во влажной камере антителами, меченными пероксидазой (конъюгат в рабочем разведении). Последующие операции и учет результатов аналогичны прямому варианту пероксидазной реакции.

Твердофазный ИФА. Применяют наиболее широко. В этом слу­чае антитела или антигены фиксируют на нерастворимых носи­телях: микропанелях, стеклянных или нейлоновых шариках.

При различных вариантах реакции результаты учитывают ин­струментально или визуально.

Обнаружение антигена по схеме «сэндвич» состо­ит из следующих этапов.

Лунки полистироловых микропанелей, сенсибилизируют спе­цифическими для искомого антигена антителами в концентра­ции 10…30 мкг/мл. Обычно в лунку вносят по 0,2 мл раствора ан­тител в буфере с рН 9,6, выдерживают при 37 °С 1 ч и затем ос­тавляют на ночь при 4 «С. Удаляют раствор иммуноглобулинов панели промывают ФСБР (рН 7,4) три раза, чтобы удалить избы­ток свободных (несорбированных) антител.

В лунки вносят по 0,2 мл раствора, содержащего исследуемый антиген, и инкубируют при 37°С 2 ч, затем панели вновь промы­вают, как ранее описано.

В лунки вносят по 0,2 мл меченных ферментом специфичес­ких антител (конъюгат); панели инкубируют при 37 °С 1…2ч, затем их отмывают от несвязавшихся антител.

В лунки вносят 0,2 мл раствора ферментного субстрата и инкубируют в темноте при 20…22 ºС 5…30 мин.

Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 н. раствора серной кислоты (для пероксидазы) и 3 М раствора гидроксида натрия (для щелочной фосфатазы).

Учет результатов визуальный или спектрофотометрический по увеличению поглощения при длине волн 490 нм (пероксидаза) или 405 нм (щелочная фосфатаза). Субстрат ОФД: положитель­ный результат — оранжево-коричневое окрашивание. Субстрат 5-аминосалициловая кислота: положительный результат — ин­тенсивное коричневое окрашивание.

За положительный результат принимают превышение оптической плотности опытных образцов над контрольными в пять-шесть раз.

Обнаружение антител (в сыворотке крови) осно­вано на том же принципе, но твердофазный носитель сенсиби­лизируют известным антигеном, обрабатывают исследуемой сы­вороткой, затем антивидовым иммуноглобулином, меченным ферментом. Вносят субстрат и по цветной реакции судят о нали­чии или отсутствии антител в исследуемой сыворотке крови.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Идентифицировать культуры возбудителей бруцеллеза и сальмонеллеза прямым МФА.

2. Идентифицировать двухступенчатым МФА культуру саль­монелл.

3. Изучить микроскопическую картину при учете результатов гистохимического ИФА (иммунопероксидазный тест).

Контрольные вопросы

1. В чем сущность одноступенчатого, двухступенчатого и трехступенчатого МФА?

2.Для каких целей используют МФА?

3.Какие разработаны варианты ИФА?

Иммунофлуоресцентный анализ

Иммунофлуоресцентный анализ (МФА — метод флуоресцирующих антител, иммунофлуоресценция) (англ. Immunofluorescence) — набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий (культур клеток, бактерий, микоплазм, риккетсий, вирусов), образцов крови, костного мозга, альвеолярных смывов, тонких тканевых срезов. Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных так и внутриклеточных белков и рецепторов. Исследование и оценка может выполняться вручную при помощи флюоресцентного микроскопа или автоматизировано с использованием проточного цитометра (flow cytometer) или микрочипового цитометра (сhip cytometer). Возможно применение конфокального микроскопа и роботизированного флюоресцентного микроскопа (в том числе совмещенных с проточным цитометром) в сочетании с программной системой обработки изображений. Имеющиеся в настоящее время автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце примерно 50 различных антигенов с использованием набора различных флюоресцентных маркеров в формате высокоинформативной микроскопии и цитометрии (методы носят названия high-content imaging, high-content cytometry, high-content screening) и примерно вдвое меньшем максимальным набором антигенов с использованием современной проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Основными практическими приложениями являются онкология, микробиология, клеточная биология, генетика, фармакология и др.

Сущность и классификация метода

Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом (англ.)русск.. В настоящее время метод использует как антитела к различным антигенам, так и специфические красители к ДНК (к примеру DAPI), РНК (к примеру Sybr Green II), липидам и белкам.

В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом, и непрямой, разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом.

При прямом методе (пМФА) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.

При непрямом методе (нМФА) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. «первые» антитела), а затем видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве «первых» антител используются мышиные антитела — mouse IgG, то в качестве «вторых» используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем. Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со «вторым» антителом.

Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, хотя в более ранних версиях метода требовалось множество моноспецифических сывороток. Долгое время недостатками прямых видов МФА являлись ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие иммуноглобулины к исследуемым антигенам. Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая степень очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода.

Поскольку прямой метод в настоящее время позволяет избежать неспецифических реакций, автоматизированные методики преимущественно используют прямой метод иммунофлуоресценции.

Результаты ручной микроскопической оценки описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырёх ++++) — субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя. В автоматизированных методах в качестве детектора используются фотоумножители или высокочувствительные флуоресцентные фотокамеры, что позволяет регистрировать сигнал с большой точностью и дает значение относительного уровня флюоресценции (relative fluorescence ratio) в широком диапазоне шкалы. Абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце. При использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *