Содержание
Оксидазные диски
| Оксидазные диски | DD018 |
Используются для дифференциации представителей родов Neisseria, Alcaligenes, Aeromonas, Vibrio, Campylobacter и Pseudomonas (обладают оксидазной активностью) от энтеробактерий (оксидазоотрицательные).
Принцип и оценка результата:
Во флакончиках находятся стерильные диски из фильтровальной бумаги, пропитанные оксалатом N,N-диметил-парафенилендиамина, аскорбиновой кислотой и a -нафтолом. С использованием таких дисков отпадает необходимость в ежедневном приготовлении свежего реактива на оксидазу. Для осуществления дыхания (биологического окисления с целью получения энергии) у некоторых бактерий имеется цитохромоксидаза, либо индофенолоксидаза – железосодержащий белок, гемопротеин, который катализирует перенос электронов от вещества-донора (например, НАД-Н) к веществам-реципиентам (обычно О2). Бесцветный N,N-диметил-парафенилендиамин служит искусственным реципиентом электронов. В ходе оксидазного теста из него в результате окислительно-восстановительных реакций с участием микробной оксидазы образуется индофенол – вещество синего цвета. Оксидазный тест полезен для первичной характеристики аэробных грамотрицательных бактерий из родов Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas, Campylobacter и Pasteurella.
Gordon и McLeod (1), используя способность некоторых бактерий в ходе окислительно-восстановительных реакций образовывать индофенол из диметилпарафенилендиамина и a -нафтола, предложили применять оксидазный тест для идентификации гонококков. Gaby и Hadley (2) предложили использовать более чувствительный метод с использованием оксалата N,N-диметил-парафенилендиамина (при этом все стафилококки стабильно давали отрицательный результат). В случае положительной реакции (наличие цитохромоксидазы) из оксалата N,N-диметил-парафенилендиамина и a -нафтола образуется синий индофенол.
Указания по применению:
Оксидазный тест проводят путем снятия микробной колонии и растирания ее по оксидазному диску. Учет реакции ведут в течение 5–10 секунд при 25–30°С. Замедленные положительные реакции появляются через 10–60 секунд. Отсутствие изменения цвета на диске или развитие окраски через 60 и более секунд расценивают, как отрицательную реакцию.
Культуральные свойства:
Реакции референс-штаммов в течение 5–10 секунд при 25–30°С
| Штаммы микроорганизмов (АТСС) | Реакция (результат) | Цвет |
| Pseudomonasaeruginosa (27853) | + | Темно-лиловый, синий |
| Staphylococcus aureus (25923) | – | Не меняется |
| Neisseria gonorrhoeae (19424) | + | Темно-лиловый, синий |
| Escherichia coli (25922) | – | Не меняется |
Внимание!
- Во избежание ложноположительных реакций не применяйте стальную или нихромовую проволоку для оксидазного теста, т. к. возможно поверхностное окисление этих металлов.
- Для оксидазного теста не подходят культуры, выращенные на средах и индикаторами (например, на среде Эндо, МакКонки и др.).
- Для учета результатов важно соблюдение временного интервала (5–10 сек).
- Оксидазный тест, ввиду его важности для идентификации, надо проводить со всеми грамотрицательными бактериями.
- Выработка цитохромоксидазы может подавляться на средах, где идет ферментация углеводов (например, на агаре МакКонки), поэтому возможны ложноотрицательные результаты теста с культурами родов Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas.
Условия хранения:
Диски хранить при 0…+8°С. Не используйте реактивы после истечения срока годности
НИЕ: материалы надо держать во влагонепроницаемых контейнерах с поглотителем влаги. Перед тем, как открыть контейнер, надо дать ему нагреться до комнатной температуры.
2. Методы идентификации грам (-) бактерий.
2.1. Оксидазный тест.
2.2. Индольный тест.
2.3.Ферментация углеводов (“пестрый ряд”).
2.4.ONPG-тест.
2.5.Утилизация цитрата.
2.6.Утилизация малоната.
2.7.Тест с трибутирином (для идентификации M.catarrhalis).
2.8.Тесты декарбоксилирования и гидролиза аминокислот.
2.9.Фенилаланиновый тест.
2.10.Сероводородный тест (H2S-тест).
2.11.Гидролиз эскулина.
2.12.Уреазный тест.
2.13.Разжижение желатина.
2.14.Тест с метиловым красным.
2.15.Тест Фогес-Проскауэра.
2.16.Редукция нитратов.
2.17.Окислительно-ферментативный (ОФ) тест.
2.1. Оксидазный тест.
Принцип. Определенные виды бактерий вырабатывают либо цитохромоксидазу, либо индофенолоксидазу (железосодержащий гемопротеин), которые катализируют перенос электронов от донаторов водорода (НАДН) к акцепторам (обычно кислороду). В оксидазном тесте бесцветный краситель p-фенилендиамин дигидрохлорид, используемый как искусственный акцептор электронов, при участии оксидазы окисляется и образует окрашенное вещество индофенол синий. Тест используют для первичной характеристики грам(-) бактерий. Особую помощь он оказывает при идентификации бактерий родов Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas, Campylobacter, Pasteurella, Neisseria.
Реагенты. Можно использовать готовые реагенты или готовить их в лаборатории. Для приготовления 1% раствора тетраметил-p-фенилендиамин дигидрохлорида добавляют 5 мл дистиллированной воды к 50 мг порошка реагента (заготовленные впрок навески реагента хранят в укупоренных пластиковых или стеклянных пробирках) и тщательно перемешивают. Реактив готовят ежедневно. Неиспользованный остаток реактива сбрасывают.
Коммерческие тесты представляют собой импрегнированные реагентом полоски или диски фильтровальной бумаги.
Контроль качества проводят в день постановки теста с культурами P. aeruginosa АТСС 27853 (положительный контроль) и E. coli АТСС 25922 (отрицательный контроль).
Ход исследования.
Прямой способ на чашках: Наносят 1 каплю реагента непосредственно на изучаемую колонию и наблюдают появление темно-фиолетового окрашивания.
Непрямой способ на фильтровальной бумаге.
Þ Помещают полоску (диск) фильтровальной бумаги в пустую чашку Петри и капают 1-2 капли реактива, либо используют готовые полоски, импрегнированные реагентом, и смачивают их деионизированной водой.
Þ Стерильным аппликатором или посевной петлей берут исследуемую колонию и размазывают ее по полоске или диску.
Þ При положительной реакции через 10-30 сек. Появляется окрашивание интенсивно синего или фиолетового цвета. При отрицательной реакции цвет не изменяется. При неопределенном результате, когда окрашивание появляется позже 30 сек., исследование необходимо повторить со свежей культурой (18-24-часовой). Как правило, грам (-) бактерии с замедленной оксидазной реакцией не принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, так как они не продуцируют фермент цитохромоксидазу.
Ограничения и предосторожности.
1) Нельзя использовать для посева культуры петли или проволоку из нержавеющей стали или нихрома, так как может наблюдаться ложно положительная реакция за счет образования продуктов окисления при обжиге петли в пламени для стерилизации.
2) Изучение бактерий, выросших на агаре МакКонки, Левина или других дифференциальных средах, не подходит для этого теста, так как индикаторы с этих сред могут дать ложно отрицательную реакцию.
3) Ложно отрицательная реакция может наблюдаться в смешанных культурах, относящихся к родам Pseudomonas и Neisseria, так как те виды Pseudomonas, которые вырабатывают оксидазу, также продуцируют некую ингибирующую субстанцию, влияющую на выработку оксидазы Neisseria spp.
4) Импрегнированную реагентом бумажную полоску после смачивания используют только 1 раз.
5) Результаты следует учитывать не более 30 сек.
6) Во избежание ошибок при выборе схемы идентификации оксидазный тест следует применять для всех грам (-) бактерий.